乌发早自为一种常见疚病，至今仍令患者惆怅，给患者带来诸多不便。乌发涂剂来源于蒙药标准，可促使黑发生长，治疗乌发早自，疗效显著，但原方使用时需剃发，反复涂抹，为了改善其不便性，本试验将其制成古方乌发膏。古方乌发膏是以西青果、诃子、木香、蔷薇茎皮等五味药物组成，经提取后加人适宜基质和促渗剂制成的乳膏剂，目前复方制剂的质量控制方式主要为TLC鉴别和含量测定，因中药有效成分具多样性和不明确性，中药指纹图谱技术作为国内外广泛应用的一种中药评价模式，符合当前正在提倡的中药质量标准提高研究，故参照已有对复方中药制剂的研究，本试验通过HPIC法建立古方乌发膏的指纹图谱，对没食子酸、木香烃内醋、去氢木香内醋化合物进行指认。其中靴质类作为处方的主要成分，故在对古方乌发膏指纹图谱进行研究的同时测定制剂中没食子酸的含量，从而为该药的质量标准制定提供更全面的参考依据。
1 材料
Agilent-126。高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT-125D型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；CSlol电热鼓风干燥箱(重庆实验设备厂制造)；电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司)。药材饮片(四川省中药饮片有限责任公司)；没食子酸对照品(批号:110831-201204，木香烃内醋对照品(批号:111；p24-201208)，去氢木香内醋对照品(批号:111525-201209)，对照品均购自中国食品药品检定研究院；古方乌发膏10批(实验室自制)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；水为超纯水(实验室自制)，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 古方乌发膏指纹图谱
2.1.1 色谱条件
色谱柱为C18(4.6mmX250mm,5pm)；流动相为0.05%磷酸的甲醇液(A)一0.05%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(1}-60min,10%~100%A；60}-70min,100%A)；检测波长为220nm；柱温为250C；流速为1.OmL/min；进样量为10碑。
2.1.2 对照品溶液制备
精密称取没食子酸、木香烃内醋、去氢木香内醋、各对照品适量，加50%甲醇溶解并稀释，分别得到浓度为0.020,0.107,0.215g/碑的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液制备
精密称取自制古方乌发膏lOg于I员I底烧瓶中，加人4mo1/I盐酸溶液100mI，称定重量，水浴加热3.sh，放冷，补重，滤过。精密量取续滤液lm工，置lOm工量瓶中，加50%的甲醇稀释至刻度，摇匀，超声lOmin，经微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.1.4 药材溶液制备
精密称取各药材适量，按“2.1.3"项下进行操作，分别得到每毫升含0.0258,0.0256,0.0253,0.0251g的诃子、西青果、木香、蔷薇茎皮药材溶液。
2.1.5 精密度试验
精密吸取供试品溶液连续6次进样，记录色谱图。以没食子酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD<0.6%，相对峰面积的RSD<1.9%，表明本方法精密度良好。
2.1.6 重复性试验
按照供试品制备方法制备6份溶液，分别测定，记录结果。结果各共有峰相对保留时间的RSD<0.8%，相对峰面积的RSD<1.7%，表明本方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验
取一份供试品溶液，室温下分别于0,1,2,4,6,8,10,12h时进行测定，记录色谱图。结果各共有峰相对保留时间的RSD均<0.56%，相对峰面积的RSD均<2.0100，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.1.8 对照图谱的建立及相似度评价
取10批古方乌发膏供试品溶液进行测定，将色谱数据导人“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”C2004A版)进行匹配，采用多点校正模式，中位数法生成对照图谱，时间窗为0.1min，结果见图1,图2，相似度计算发现10批供试品相似度均>0.9.
2.1.9 特征指纹图谱分析
分析各供试品指纹图谱，其中没食子酸是整个处方中君药的主要成分，保留时间适中，峰形稳定，峰面积适中，与其他峰分离良好，故采用此峰作为参比峰。比较古方乌发膏全方与各药材溶液、对照品溶液的保留时间和图谱，认定色谱峰的来源。本试验选取具代表性的17个峰为共有指纹峰，且共有指纹峰的面积古总面积的90%以上，其中8号特征峰来源于诃子，7号特征峰来源于西青果，16号特征峰来源于木香，1,2,3,5,10,12,15号特征峰为各药材共有峰；3,13,14号峰被分别指认为没食子酸、木香烃内醋、去氢木香内醋。结果说明所建立的古方乌发膏指纹图谱对处方中三味药材的质量控制有实际意义，而蔷薇茎皮在该指纹图谱中无体现，可能主要化学成分在该波长下无紫外吸收或响应较低。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件
色谱柱为C18(4.6mmX250mm,5pm)，流动相为0.0500磷酸的甲醇液(A)一0.0500磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0-}-7min,1%}5%A；7}15min,5%一18%A；15^-20min,18%A)，检测波长为220nm，柱温为250C，流速为1.OmL/min，进样量为10碑。
2.2.2 线性关系考察
制备0.4pg/pI的没食子酸对照品溶液，梯度稀释，得到浓度为0.040,0.020,0.016,0.012,0.008,0.004pg/碑的一系列对照品溶液，精密吸取各浓度对照品溶液lO碑，分别注人高效液相色谱仪，按照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品含量(X)为横坐标，绘制标准曲线。线性回归得到回归方程为:Y=2693.70526X}6.69321(r=0.99979。结果表明没食子酸浓度在0.04-}-0.40pg/碑内呈良好的线性关系。
2.2.3 精密度试验
取0.02pg/pI没食子酸对照品溶液，按照上述方法测其峰面积，连续测定5次，计算得没食子酸的峰面积平均值为；p；pl.；p09>RSD为0.7300，表明仪器精密度良好。
2.2.4 重复性试验
取同一批制备的古方乌发膏成品，根据上述供试品溶液制备方法进行操作，平行制备5份供试品溶液，测得没食子酸的平均含量为0.1006mg/g,RSD为1.2900，说明该方法重复性良好。
2.2.5 稳定性试验
取上述试验的供试品溶液，分别于0,2,4,8,12,16,24h测定其没食子酸含量，计算得没食子酸平均含量为0.1034mg/g,RSD为1.97%，表明该溶液在24h内稳定。
2.2.6 加样回收试验
按照“2.1.3”项下进行操作，得到滤液，从中精密量取9份，每份约lm工，置lOm工量瓶中，按照试验要求取适量没食子酸对照品溶液，加劝%的甲醇稀释至刻度，摇匀，超声lOmin，即得样品溶液。测定没食子酸的含量，计算出没食子酸的平均回收率，结果见表202.2.7样品含量侧定取5批古方乌发膏样品，按上述操作测定古方乌发膏中没食子酸的含量，得到古方乌发膏中没食子酸的含量平均为0.10；i9mg/g。
3 讨论
3.1 检测波长
本试验通过DAD全波长扫描，扫描波长为19。一400nm，分析3D光谱图，发现大部分物质在220nm处显最强吸收，故设定220nm为古方乌发膏的检测波长。
3.2 供试品制备溶剂
参考相关文献g，分别考察了.)U%甲醇、IU%甲醇、90%甲醇、甲醇对没食子酸的提取率以及对色谱峰性能的影响，结果表明劝%甲醇作为供试品制备溶剂，供试品溶液中的没食子酸含量高且色谱峰分离度高、对称性好。
3.3 色谱条件优化
分别考察了甲醇一水、甲醇-U.03%磷酸水溶液、甲醇一0.U5%磷酸水溶液、U.U5%磷酸甲醇液一0.U5%磷酸水溶液等多种流动相。结果表明酸性条件下，没食子酸的峰形、分离度及其他色谱峰的检出等得到良好改善，而选用0.05%磷酸甲醇液一0.U5%磷酸水溶液，峰形效果最好，同时有效解决了醇一水系统梯度洗脱下的基线漂移问题，故选择该体系作为色谱条件的流动相。为快速有效测定目标成分的含量，含量测定中的色谱条件做出调整，使分析时间变短，操作更为方便、简单。
3.4 特征指纹图谱
由于诃子、西青果、蔷薇茎皮的主要提取物为靴质类物质，且诃子为使君子科植物诃子的干燥成熟果实，西青果为使君子科植物诃子的幼果，两者来源相同，故只对17个共有指纹峰中的一部分进行了来源归属，其余为四种药材的共有峰。
4 结语
HPLC作为特征图谱与指纹图谱最常用的方法0，具有分离功能强、分析速度快、样品适用性广泛、检测器种类多和系统稳定性好等优势。本试验用该法对制剂进行指纹图谱研究和含量测定，10批供试品相似度>U.9，说明该制剂质量较稳定，对17个共有指纹峰分别进行归属，基本阐明该复方制剂的主要化学成分，该方法的建立和对目标成分没食子酸的含量测定方法的建立为古方乌发膏的质量控制提供了依据。
362716231
