柑桔黄龙病（ＣｉｔｒｕｓＨｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ，ＨＬＢ）是柑桔生产上的毁灭性病害，该病是由限制于韧皮部的革兰氏阴性细菌———韧皮部杆菌属（Ca狀犱犻犱犪狋狌狊Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）引起，通过带病苗木、接穗及柑桔木虱进行传播。在中国，Ｒｅｉｎｋｉｎｇ（１９１９）最早报道在广东的珠江三角洲地区有柑桔黄龙病的发生，据种植者的观察此病可追溯到１９世纪８０年代的广东潮汕地区。在２００４年以前，黄龙病仅在亚洲东南部、非洲南部的国家和地区发生。２００４年和２００５年相继在巴西圣保罗地区和美国佛罗里达州发现了黄龙病。现在该病害已广泛分布于亚洲、美洲和非洲等５０多个国家和地区。目前发现的柑桔黄龙病菌有亚洲种（“Ca．Ｌ．ａｓｉａｔｉｃｕｓ”）、非洲种（“Ca．Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ”）和美洲种（“Ca．Ｌ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ”）。我国于１９９６年首次应用ＰＣＲ技术检测柑桔植株体内的黄龙病菌。近年来，柑桔黄龙病不断扩散蔓延，严重影响柑桔产业的发展。蒋军喜等２００５—２００８年田间调查和室内ＰＣＲ检测结果表明，江西省抚州地区无柑桔黄龙病发生。然而，２０１２年以来柑桔黄龙病在江西赣州地区大暴发，黄龙病极可能蔓延到抚州地区。南丰蜜桔是抚州地区的特色主导产业，截至２０１６年，当地南丰蜜桔种植面积达４．６７万ｈｍ２（７０万亩），年产量１２５万ｔ，是２０万农民增收致富的主业。如果抚州地区的南丰蜜桔感染黄龙病菌，将对江西南丰蜜桔产业造成严重影响。２０１５年１０月抚州地区南丰县和广昌县的南丰蜜桔植株出现了类似黄龙病的症状。为探明抚州地区南丰蜜桔是否携带黄龙病菌，笔者对采自田间的疑似黄龙病症状的南丰蜜桔，利用黄龙病菌１６ＳｒＤＮＡ的特异引物ＯＩ１／ＯＩ２ｃ以及β操纵子基因的特异引物Ａ２／Ｊ５进行鉴定，并通过测序进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集及总DNA提取

于２０１５年１０月在江西省抚州地区广昌县和南丰县采集疑似黄龙病症状（典型黄龙病斑驳症状）的南丰蜜桔叶片样品，两地各８份。采用ＯＭＥＧＡ公司植物ＤＮＡ提取试剂盒提取叶片ＤＮＡ。取５μＬＤＮＡ溶液于１％琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）中观察提取的ＤＮＡ纯度，其余置于－２０℃下保存备用。

1.2 PCR扩增

引物序列（５’—３’）：ＯＩ１为ＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ，ＯＩ２ｃ为ＧＣＣＴＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＣＣＡＴ，Ａ２为ＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴ，Ｊ５为ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＣＧＡＡＣＡＡ。　　引物扩增片段长度：ＯＩ１／ＯＩ２ｃ为１１６７ｂｐ［９］，Ａ２／Ｊ５为７０３ｂｐ。　　

ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）组成：１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１７．６μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬＰｒｉｍｅｒＦ０．５μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬＰｒｉｍｅｒＲ０．５μＬ，２．５Ｕ／μＬＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．４μＬ，ＤＮＡ模板１．０μＬ。　　

ＰＣＲ反应程序：９６℃５ｍｉｎ；９５℃４５ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃７ｍｉｎ。　　

ＰＣＲ完成后取５μＬ反应产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，电压１３０Ｖ，电泳３０ｍｉｎ，采用凝胶成像系统观察目的条带。

1.3 16SrDNA片段克隆与测序

采用全式金生物（ＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈ）ＥａｓｙＰｕｒｅ?ＰＣＲ纯化试剂盒对以上引物扩增出来的目的条带进行纯化、回收，将纯化的片段连接到ｐＥＡＳＹＴ１ｖｅｃｔｏｒ，并转入大肠杆菌ＤＨＴ１感受态细胞，通过ＰＣＲ扩增筛选获得阳性克隆子，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 同源性比对及系统发育树构建

利用ＢＬＡＳＴ软件，将以上测序结果与Ｇｅｎｂａｎｋ中的９条与黄龙病菌相关的１６ＳｒＤＮＡ部分核苷酸序列进行同源性分析，同时利用ＭＥＧＡ６软件中的最大似然法构建系统发育树。这９条序列包括：来自中国广东、美国佛罗里达、中国江西的柑桔黄龙病菌亚洲种（基因库登录号分别为ＤＱ１５７２７３、ＥＵ１３０５５３和ＤＱ４３２００３），柑桔黄龙病菌非洲种（基因库登录号为Ｌ２２５３３），柑桔黄龙病菌美洲种（基因库登录号为ＡＹ７４２８２４），马铃薯斑马病菌“Ca．Ｌ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ”（基因库登录号为ＧＵ３７３０４８），在山木瓜上发现的一种可培养的韧皮部杆菌“犔犻犫犲狉犻犫犪犮狋犲狉犮狉犲狊犮犲狀狊”（基因库登录号为ＪＸ４３００２５），根瘤菌“犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐ．”（基因库登录号为ＤＱ３３７５８０）以及α亚纲细菌“犛犻狀狅狉犺犻狕狅犫犻狌犿犿犲犾犻狋犻ｓｔｒａｉｎＳ３３”（基因库登录号为ＤＱ４２３２４６）。最大似然法分析前，使用ＭＥＧＡ６中的ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ估计对比序列的最优替代模型，其中（ＨＫＹ＋Ｇ）为最优。分支中的节点支持通过自展分析（ｂｏｏｔｓｔｒａｐａｎａｌｙｓｉｓ）计算，设１０００次重复。

2 结果与分析

2.1 犘犆犚

结果两地叶片样品提取的总ＤＮＡ纯度（Ａ２６０／Ａ２８０）１．８９～２．１２之间。用ＯＩ１／ＯＩ２ｃ和Ａ２／Ｊ５引物进行ＰＣＲ扩增，均可分别扩增出１１６７ｂｐ和７０３ｂｐ的特异条带（见图１和图２）。说明所采集的样品均感染黄龙病。

2.2 同源性

分析结果看出，抚州南丰蜜桔黄龙病菌１６ＳｒＤＮＡ片段序列与柑桔黄龙病菌亚洲种１６ＳｒＤＮＡ片段序列的同源性为９９％～１００％。其中，与来自中国广东的黄龙病菌亚洲种（基因库登录号ＤＱ１５７２７３）的相似性为１００％，与来自中国江西宫川温州蜜柑黄龙病菌亚洲种（基因库登录号ＤＱ４３２００３）的相似性为９９％。与黄龙病菌非洲种的同源性为９７％，与黄龙病菌美洲种的同源性为９５％。因此，从分子水平上证明抚州南丰蜜桔黄龙病菌为亚洲种。

2.3 系统发育树

从构建的系统发育树可看出，江西省抚州地区广昌县和南丰县的南丰蜜桔黄龙病菌与黄龙病菌亚洲种归为一类（见图３）。这说明广昌县和南丰县的南丰蜜桔黄龙病菌属于黄龙病菌亚洲种。

3 讨论

南丰蜜桔是我国柑桔的优良品种，也是江西抚州的传统特色产品，迄今已有１３００多年的栽培历史。在本研究以前，未见江西抚州南丰蜜桔感染黄龙病菌感染的报道。２０１５年１０月抚州地区南丰县和广昌县的南丰蜜桔植株出现类似黄龙病的症状后，笔者进行系统研究的结果表明，南丰县和广昌县的南丰蜜桔均感染了黄龙病菌，且病菌的１６ＳｒＤＮＡ片段序列与柑桔黄龙病亚洲种１６ＳｒＤＮＡ片段序列的相似性为９９％～１００％，即南丰蜜桔黄龙病菌属于亚洲种。因此，建议江西抚州积极做好黄龙病的防治工作，在辖区内进行全面普查，及时挖除病株。另外，在区域层面上应推广使用无病苗木，并做好柑桔木虱的统防统治工作；在果园管理上应加强肥水管理，增强植株的抗病能力。