超声造影可明显提高脑血管病临床诊断能力，低机械指数实时成像有可能成为脑灌注评估的新方法。造影剂的风险主要来自其与超声波相互作用引起的生物学效应，高机械指数条件下造影剂微泡可一定程度上引起组织细胞凋亡。本研究探讨低机械指数超声辐照SonoVue对脑缺血模型大鼠脑组织细胞凋亡诱导的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

SPF级成年Wista:大鼠56只，雌雄不限，体质量(210士30)g，由内蒙古大学实验动物中心提供。随机分为对照组10只，低剂量模型组12只，中剂量模型组12只，高剂量模型组12只和高剂量造影剂组10只。其中对照组和高剂量造影剂组脑供血正常，低、中、高剂量模型组结扎双侧颈动脉制作脑缺血模型。辐照开始时，低、中、高剂量模型组和高剂量造影剂组分别经尾静脉快速推注。. 18, 3. 6, 9. 0,9.() mI丫kg SonoVue溶液。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

SonoVue'M(意大利Bracco公司)，造影前用5 mI、生理盐水将造影剂冻干粉溶解，振荡混匀备用，其浓度为11. 8 mg/mI，气泡浓度为2 X 10} /mI。原位细胞凋亡检测试剂盒(P()I}法)、DNase 1 ( Roche公司)、Proteinase K工作液(10一20 mg/I.溶于10 mmol/I. Tris/HC1, pH 7. 2一8.())、I}AB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，质量分数20%乌拉坦(上海市国药集团化学试剂有限公司)，体积分数生%多聚甲醛/PBS溶液(天津市福晨化学试剂厂)，DREMEI、电磨钻(美国达美公司)，Logiq E9彩超仪(GE公司)。

1.2.2 脑缺血模型

制作低、中、高剂量模型组采用结扎双侧颈动脉方法制作脑缺血模型。大鼠术前禁食、水12 h，质量分数20%乌拉坦75。一1。()() mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，分离左侧颈总动脉及与伴行的迷走、交感神经，双线结结扎该侧颈总动脉，同样过程结扎右侧颈总动脉，观察术野无出血，无血管和神经损伤后，缝合皮肤各层。

1.2.3 人造声窗

5组大鼠均行人造声窗。麻醉成功后，大鼠俯卧位，于冠状缝前、后约5 mm处确定开颅位置，用连接T型砂磨片的电磨钻于开颅位置对称打磨2个骨槽，松动并去除骨片，形成大小约8 mm X3 mm声窗，以备超声辐照用。

1.2.4 超声辐照

应用Logiq E9彩超仪，探头频率15 MHz,MSK Sup条件，机械指数。. 09，组织热指数。.()()，探查深度2. 0 cm,聚焦位置1. 2 cm。探头经颅顶声窗冠状面扫查，显示端脑、间脑，视交叉后切面作为辐照平面(图1),辐照时间20 minx辐照开始后，即刻经尾静脉快速推注SonoVue溶液，按实验要求，低、中、高剂量模型组和高剂量造影剂组分别给予。. 18, 3 .6、9.U、9盐水冲管。() mI./kg SonoVue溶液，追加1 mI生理超声辐照时相点为开颅后6 ho

1.2.5 组织病理学检查

5组大鼠辐照12 h后采用脱臼法处死，生理盐水、体积分数生%多聚甲醛溶液各50 mI心脏灌注，去颅骨取脑组织，多聚甲醛溶液固定12 h，常规石蜡包埋、切片，行组织病理学HE染色观察脑组织形态变化。

1.2.6 脑细胞凋亡情况

采用TUNEI、法检测脑细胞凋亡情况。凋亡细胞计数方法:在普通光镜下随机连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，换算平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为凋亡指数(apoptosisindex，AI)。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.。软件进行统计分析，计量资料以均数士标准差(王士、)表示，比较采用t检验和方差分析，PGO. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑组织病理学检查结果

对照组和高剂量造影剂组脑组织未见明显形态学改变。低、中、高剂量模型组大鼠端脑顶叶、侧叶、矢状沟两侧和海马区可见明显缺血病灶，呈局限性(图2a)和/或弥漫性(图2b>淡染的缺血改变，以顶叶较明显，坏死细胞数量较多，但间脑均未见明显缺血改变。高倍镜下典型凋亡细胞表现为细胞膜完整，细胞固缩，核染色质边集，TUNEI、法染色呈深棕色，易于与坏死细胞区分。对照组和高剂量造影剂组未见坏死细胞，在端脑、间脑部位可见散发凋亡细胞。低、中、高剂量模型组大量凋亡细胞主要分布于缺血坏死灶周围，即“半暗带”区，在皮层边缘区、海马区也可见凋亡细胞。

2.2   5组脑组织凋亡细胞AI值比较

低、中、高剂量模型组AI值(288. 30士133. 73, 216. 96士109. 63223. 97士100. 38)高于对照组(78. 92士39. 38)和高剂量造影剂组(126. 97士62.91)(PG0.01);低、中、高剂量模型组AI值比较差异无统计学意义(PLO. 05)，对照组AI值与高剂量造影剂组比较差异无统计学意义(P>0. 05)。

3 讨论    

研究结果证实，医用诊断超声可引起组织细胞凋亡，在低频高机械指数超声下，超声辐照组织细胞30 min可引起组织细胞凋亡率增加。体外实验研究结果川证实，微泡可增强或诱发超声的空化作用和声孔效应，引起I}NA损伤、细胞膜通透性增加及细胞凋亡，其主要机制与超声波的空化效应有关，空化效应在空化核存在下作用倍增，超声造影中，大量引入的造影剂微泡成为空化效应的增强剂，增大了组织细胞损伤的风险。超声波的机械效应可导致细胞膜损伤，损伤后的组织细胞对自身修复能力不足以维持细胞生存时，细胞发生凋亡。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，存在于各种组织和器官的发育、生长过程中，是生物体维持内环境稳定的重要机制川。   

 本研究采用较低的机械指数值作为超声波声能输出的重要参数，超声联合微泡发生空化效应所需的声能强度未能达到阑值，从而使微泡空化核的扩大、增强作用未完全发挥，在高剂量造影剂组仅表现为偶发凋亡细胞，脑细胞凋亡指数与对照组比较差异无统计学意义。白文坤等川在研究前列腺癌细胞凋亡诱导后证实机械指数相比微泡剂量对凋亡诱导的作用更大，对细胞凋亡影响因索作用的大小为超声功率>微泡浓度>辐照时间。有研究结果川发现，超声诱导细胞凋亡与超声的作用时间有关，SonoVue内含六氟化硫气体，平均消除半衰期为12 min，注射15 min后几乎所有气体均排出，本研究中超声辐照时间为20 min，因此，对微泡扩增作用的发挥不会造成较大影响。张波等川用低频超声辐照联合微泡对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡进行研究，结果发现细胞死亡和凋亡与微泡浓度有关。本研究结果显示，低、中、高剂量模型组脑细胞AI值两两比较差异均无统计学意义，提示不同微泡剂量并未导致凋亡细胞计数水平差异，3个不同剂量水平上，微泡在诱导细胞凋亡上的作用较小，可能原因为大量微泡的存在并发挥凋亡扩增作用需超声波的强度达一定阑值。 Stroick等通过诱导大鼠脑出血造模，静脉持续输注造影剂SonoVue并经颅超声辐照30 min，结果发现超声微泡对出血灶大小、脑水肿程度和脑细胞凋亡率无明显影响。Fatar等应用超声造影评价大鼠大脑中动脉梗阻模型的实验研究结果证实，超声造影组超声联合微泡在脑梗死范围、细胞凋亡、白细胞介索和肿瘤坏死因子一a水平与对照组比较差异无统计学意义。本研究结果显示，低、中、高剂量模型组脑细胞AI值明显高于对照组和高剂量造影剂组，提示低、中、高剂量模型组大量凋亡细胞存在缺血、缺氧是主要诱因。对照组和高剂量造影剂组凋亡细胞分布随机且数量较少，低、中、高剂量模型组分布主要集中于顶叶、皮层边缘区，这些区域是缺血相对严重且声场声能较大区域，实验过程中反映出的微泡高灌注区的间脑部位凋亡细胞较少。    

本研究结果提示，在低机械指数为。. 09条件下，SonoVue对生理和缺血状态的脑组织细胞凋亡诱导无明显促进作用，检查时间簇20  min、给药剂量簇9. 0 mI./kg是相对安全的。由于造影剂影响组织细胞安全性过程涉及多种因索，且在造影效果和安全上构成了相互制约关系，各种因索间相互作用机制复杂，在临床颅脑超声造影广泛开展之前还需对造影剂安全性评估行进一步研究。